เมื่อพระมหาอุปราชาแตกทัพกลับไปครั้งก่อน  ทำให้พระเจ้าหงสาวดีนันทบุเรงทรงพระวิตกยิ่งนัก  เพราะว่าพม่าเสียทั้งรี้พลและอำนาจ  เป็นเหตุให้เมืองขึ้นต่าง ๆ ของพม่าเกิดความเคลื่อนไหวที่จะแข็งเมืองทั่วไป  การที่จะรักษาอำนาจพม่าไว้ได้ ก็ด้วยการเอาชนะไทยให้ได้  พระเจ้าหงสาวดีจึงให้พระมหาอุปราชา  ยกทัพมาตีกรุงศรีอยุธยาอีก ในปี พ.ศ. 2135
            ตามพงศาวดารกล่าวไว้ว่า  พระเจ้าหงสาวดีได้ตัดพ้อในที่ประชุมเจ้านายและขุนนาง  ถึงการที่ไม่มีใครเจ็บร้อนเรื่องเมืองไทย  สมเด็จพระนเรศวรมีรี้พลเพียงหยิบมือเดียว  ก็ไม่มีใครกล้าไปรบพุ่ง  เมืองหงสาวดีคงสิ้นคนดีเสียแล้ว  ขุนนางคนหนึ่งจึงกราบทูลว่า  กรุงศรีอยุธยานั้น สำคัญอยู่ที่สมเด็จพระนเรศวรพระองค์เดียว  เพราะกำลังหนุ่มรบพุ่งเข้มแข็ง  ทั้งบังคับบัญชาผู้คนก็สิทธิ์ขาด  มีคนน้อยก็เหมือนมีคนมาก  เจ้านายในกรุงหงสาวดีที่ทำสงครามเข้มแข็ง เคยชนะศึกเหมือนอย่างสมเด็จพระนเรศวรก็มีอยู่หลายองค์  ถ้าจัดกองทัพให้เป็นหลายกองทัพ แล้วให้เจ้านายดังกล่าวเป็นแม่ทัพ  ยกไปช่วยรบก็เห็นเอาชัยชนะได้  พระเจ้าหงสาวดีก็ได้ตรัสตอบ ตามที่ปรากฎในพระราชพงศาวดารว่า  ข้อเสนอนั้นก็ดีอยู่  แต่ตัวของพระองค์เป็นคนอาภัพ ไม่เหมือนพระมหาธรรมราชาซึ่งมีลูก  พ่อไม่ต้องพักใช้ให้ไปรบ มีแต่กลับจะต้องห้ามเสียอีก  ตัวของพระองค์เองไม่รู้ว่าจะใช้ใคร  พระมหาอุปราชาได้ยินดังนั้น ก็เกิดความอัปยศอดสู  จึงกราบทูลว่าขอรับอาสามาตีเมืองไทยแก้ตัวใหม่
            สงครามคราวนี้ ทางพม่าเกณฑ์กองทัพ 3 เมือง คือ กองทัพเมืองหงสาวดี ให้เจ้าเมืองจาปะโร เป็นกองหน้า  พระมหาอุปราชา เป็นกองหลวง  กองทัพเมืองแปร ให้พระเจ้าแปรลูกเธอที่ไปตีเมืองคังได้เมื่อครั้งหลัง เป็นนายทัพ  กองทัพเมืองตองอู ให้นัดจินหน่อง ลูกพระเจ้าตองอู  ผู้ต้านทานกองทัพไทยไว้ได้เมื่อคราวที่พระเจ้าหงสาวดีล่าทัพจากเมืองไทย  เป็นนายทัพ  รวมกำลังพลทั้งสิ้น 240,000 คน  นอกจากนั้น ยังให้พระเจ้าเชียงใหม่ ยกกองทัพเมืองใหม่ใหม่ ลงมาสมทบด้วยอีกหนึ่งกองทัพ
            กองทัพพระมหาอุปราชายกออกจากเมืองหงสาวดี  เมื่อวันพุธ ขึ้น 7 ค่ำ เดือนอ้าย ปีมะโรง พ.ศ. 2135  เดินทัพมาทางด่านเจดีย์สามองค์  เมื่อล่วงเข้าถึงตำบลไทรโยค ก็ให้ตั้งค่ายลง แล้วปรึกษาแผนการที่จะเข้าตีเมืองกาญจนบุรี  และเมื่อล่วงมาถึงลำตะเพินในตำบลลาดหญ้า  ก็ให้พระยาจิตตองคุมพลสร้างสะพานเรือก เพื่อใช้ข้ามลำน้ำสายนี้  เมื่อเข้าเมืองกาญจนบุรีได้ก็พักอยู่หนึ่งคืน  แล้วเคลื่อนทัพมายังตำบลตระพังกรุ  แขวงเมืองกาญจนบุรี  พระมหาอุปราชาก็ทรงให้ตั้งค่ายแบบดาวล้อมเดือน ตรงชัยภูมินาคนาม  ทัพพม่ายกมาครั้งนี้ จนล่วงเข้าเขตกาญจนบุรี ไม่มีทัพไทยไปขัดตาทัพเลย  จึงยกเข้ามาได้ตามลำดับ จนเข้าเขตเมืองสุพรรณบุรี แขวงบ้านพนมทวนเวลาบ่ายสามโมง เกิดลมเวรัมภาพัดหมุนเป็นเกลียว ทำให้เศวตฉัตรของพระมหาอุปราชาหักสะบั้นลง  พระมหาอุปราชาเห็นเป็นลางร้าย มีความหวาดหวั่นพรั่นพระหฤทัยที่จะมาทำสงครามเพิ่มมากขึ้น  กองทัพพม่ายกมาถึงตำบลตระพังกรุ แขวงเมืองสุพรรณบุรี ก็ให้หยุดตั้งทัพอยู่ ณ ที่นั้น  แล้วให้สมิงจอดราน  สมิงเป่อ  สมิงซาม่วน คุมกองทัพม้า ออกลาดตระเวณหาข่าวกองทัพพม่าที่จะยกลงมาทางเหนือ  และสืบข่าวกองทัพฝ่ายไทย ว่าได้ยกออกมาและวางกำลังต่อสู้ไว้ที่ใดบ้าง
            กองทัพพม่าที่ยกมาครั้งนี้ ในพระราชพงศาวดารกล่าวว่า ได้รบกันที่แขวงเมืองสุพรรณบุรี  และกล่าวถึงกองทัพพระมหาอุปราชาเพียงทัพเดียว  ไม่ปรากฎอีกสองกองทัพ คือกองทัพพระเจ้าแปร และกองทัพนัดจินหน่องแต่อย่างใด  เรื่องนี้ สมเด็จกรมพระยาดำรงราชานุภาพทรงสันนิษฐานว่า  กองทัพพม่าที่ยกมาครั้งนี้ น่าจะยกมาสองทาง คือ กองทัพพระมหาอุปราชายกมาทางด่านเจดีย์สามองค์  ส่วนอีกสองกองทัพยกมาทางด่านแม่ละเมา  และให้พระเจ้าเชียงใหม่คุมเรือเป็นกองลงมาเช่นคราวก่อน  กำหนดให้กองทัพที่ยกมาทั้งสองทางนี้ มารวมกันที่กรุงศรีอยุธยา  แต่เมื่อฝ่ายไทย ตีกองทัพพระมหาอุปราชาแตกไปก่อนแล้ว ก็เป็นอันสิ้นสุดสงคราม  ทัพพม่าอีกสองกองทัพที่ยกมาทางเหนือ  เดินทางมาถึงทีหลัง  จึงยังไม่ทันเข้ารบพุ่งเลยต้องถอยกลับไป  ข้อสันนิษฐานนี้น่าจะเป็นไปได้มากที่สุด  เพราะแม้แต่จะมีหลักฐานบางแห่งกล่าวว่า  ทัพเจ้าเมืองแปรเป็นปีกซ้าย  ทัพเจ้าเมืองตองอูเป็นปีกขวา  เมื่อพิจารณาภูมิประเทศของเส้นทางเดินทัพมาทางด่านเจดีย์สามองค์  ห้องภูมิประเทศจะไม่อำนวยให้จัดทัพเช่นนั้นได้ จะทำได้เมื่อกองทัพเข้าสู่ที่ราบแล้วเท่านั้น และถ้าเป็นเช่นนั้นจริง ควรจะได้ปรากฎการปฏิบัติการของกองทัพทั้งสอง บันทึกไว้แน่นอน
            ฝ่ายสมเด็จพระนเรศวร  ตั้งแต่กองทัพพระมหาอุปราชาแตกกลับไปเมื่อครั้งก่อน พระองค์ก็ทรงประมาณสถานการณ์ว่า ไทยคงจะว่างศึกไปสักปีสองปี  เพราะข้าศึกบอบช้ำมาก ต้องใช้เวลาฟื้นฟูเป็นเวลานาน  ดังนั้นในปีมะโรง พ.ศ. 2135  ทรงวางแผนที่จะไปตีกรุงกัมพูชา  เนื่องจากในระหว่างที่ไทยทำศึกติดพันอยู่กับพม่านั้น  เขมรจะฉวยโอกาสเข้ามาซ้ำเติมไทยอยู่หลายครั้ง  แม้ต่อมาเมื่อเขมรเห็นว่าไทยเข้มแข็งขึ้น  รบชนะพม่าทุกครั้งจะรีบเข้ามาขอเป็นไมตรีกับไทยก็ตาม  แต่ครั้นเห็นพระเจ้าหงสาวดีนันทบุเรง ยกกองทัพใหญ่เข้ามาล้อมกรุงศรีอยุธยา  เขมรคาดว่าไทยจะสู้พม่าไม่ได้  ก็หันกลับไปสู่พฤติกรรมเดิม  ฉวยโอกาสยกกำลังเข้ามาโจมตีไทยอีก  พระองค์จึงคอยหาโอกาส ที่จะยกกำลังไปปราบปรามเขมรให้สำนึกตน  ครั้นถึงเดือนอ้าย ปีมะโรง พ.ศ. 2135  พระองค์ได้ทรงให้มีท้องตรา เกณฑ์ทัพเพื่อไปตีเมืองเขมร  กำหนดให้ยกทัพไปในเดือนยี่  พอมีท้องตราไปได้ 6 วัน ถึงวันขึ้น 12 ค่ำ เดือนยี่  ก็ได้รับใบบอกจากเมืองกาญจนบุรีว่า  พระเจ้าหงสาวดีทรงให้พระมหาอุปราชา ยกกองทัพเข้ามาทางด่านเจดีย์สามองค์  และได้ข่าวจากหัวเมืองเหนือว่า  มีกองทัพข้าศึกยกลงมาอีกทางหนึ่ง
            ด้วยพระอัจฉริยภาพของพระองค์  ทรงพระราชดำริว่าข้าศึกยกลงมาสองทาง  ถ้าปล่อยให้มาสมทบกันได้ ก็จะทำให้ข้าศึกมีกำลังมาก  เมื่อกองทัพพระมหาอุปราชายกเข้ามาก่อน  จึงจะต้องชิงตีให้แตกเสียก่อน เป็นการรวมกำลังเข้ากระทำการต่อข้าศึกเป็นส่วนๆ ไป  เช่นที่เคยเอาชนะกองทัพพระยาพสิม  ก่อนที่กองทัพพระเจ้าเชียงใหม่จะยกลงมาถึง ในสงครามครั้งแรก   ดังนั้น จากการเตรียมประชุมพลที่ทุ่งบางขวด เพื่อเตรียมยกไปตีกรุงกัมพูชา  ก็เปลี่ยนมาเป็นประชุมพลที่ทุ่งป่าโมก  แขวงเมืองวิเศษไชชาญ  อันเป็นเส้นทางร่วมที่จะยกทัพไปเมืองสุพรรณบุรี  และไปเมืองเหนือได้ทั้งสองทาง
            ในระหว่างนั้น พระองค์ก็ทรงให้พระอมรินทรฤาไชย  ผู้ว่าราชการเมืองราชบุรี คุมพล 500 คน  จัดกำลังแบบกองโจร ออกไปปฏิบัติการตีตัดเส้นทางลำเลียง  และรื้อสะพานทางเดินทัพของข้าศึกทางด้านหลัง  จัดทัพหัวเมือง ตรี จัตวา  และหัวเมืองปักษ์ใต้ รวม 23 หัวเมือง  รวมกำลังพลได้ 50,000 คน  ให้พระยาศรีไสยณรงค์เป็นนายทัพ พระยาราชฤทธานนท์เป็นยกกระบัตร คุมกองทัพหัวเมือง ไปตั้งขัดตาทัพสะกัดข้าศึกอยู่ที่ลำน้ำท่าคอย  แขวงเมืองสุพรรณบุรี  เมื่อเตรียมทัพหลวงเสร็จ  สมเด็จพระนเรศวร กับสมเด็จพระเอกาทศรถ ก็เสด็จโดยกระบวนเรือพระที่นั่งจากพระนคร  ไปทำพิธีฟันไม้ข่มนามที่ทุ่งลุมพลี เมื่อวันขึ้น 9 ค่ำ เดือนยี่  แล้วเสด็จไปยังที่ตั้งทัพชัย ที่ตำบลมะม่วงหวาน  หยุดปรับกระบวนทัพอยู่สามคืน  พอวันขึ้น 12 ค่ำ ก็เสด็จยกกองทัพหลวงมีกำลังพล 100,000 คน  ออกจากทุ่งป่าโมกไปเมืองสุพรรณบุรีทางบ้านสามโก้  ข้ามลำน้ำสุพรรณที่ท่าท้าวอู่ทอง  ไปถึงค่ายหลวงที่หนองสาหร่ายริมลำน้ำท่าคอย เมื่อวันขึ้น 14 ค่ำ

            มีความในพระราชพงศาวดาร แสดงถึงความอัศจรรย์ตอนหนึ่งว่า  ขณะเมื่อสมเด็จพระนเรศวร ประทับอยู่ที่ค่ายหลวง ตำบลมะขามหวาน  ก่อนวันที่จะเสด็จยกกองทัพไปเมืองสุพรรณบุรี  ในตอนกลางคืน พระองค์ทรงพระสุบินว่า มีน้ำท่วมป่า หลากมาแต่ทางทิศตะวันตก  พระองค์เสด็จลุยน้ำไปพบจรเข้ใหญ่ตัวหนึ่ง ได้เข้าต่อสู้กัน ทรงประหารจรเข้นั้นสิ้นชีวิตด้วยฝีพระหัตถ์ สายน้ำนั้นก็เหือดแห้งไป  ทรงมีรับสั่งให้โหรทำนายพระสุบินนั้น  พระยาโหราธิบดีกราบทูลพยากรณ์ว่า เสด็จไปคราวนี้จะได้รบพุ่งกับข้าศึก เป็นมหายุทธสงคราม ถึงได้ทำยุทธหัตถีและจะมีชัยชนะข้าศึก
            มีเรื่องของศุภนิมิตครั้งที่สองที่ได้กล่าวไว้ในที่บางแห่งว่า  เมื่อใกล้ฤกษ์ยกทัพ  สมเด็จพระนเรศวรและสมเด็จพระเอกาทศรถ  เสด็จไปยังเกยทรงช้างพระที่นั่งตามพิชัยฤกษ์นั้น  พระองค์ได้ทอดพระเนตรเห็นพระบรมสารีริกธาตุ ขนาดเท่าผลส้มเกลี้ยง  ส่องแสงเรืองอร่าม ลอยมาในท้องฟ้าทางทิศใต้  แล้วลอยวนรอบกองทัพไทย เป็นทักษิณาวัตรสามรอบ  จากนั้นจึงลอยขึ้นไปทางทิศเหนือ  สมเด็จพระนเรศวร  และพระอนุชาทรงปิติยินดีตื้นตันพระราชหฤทัยยิ่งนัก  ทรงนมัสการและอธิษฐานให้  พระบรมสารีริกธาตุนั้น ปกป้องคุ้มครองกองทัพไทย ให้พ้นอันตรายจากผองภัยทั้งมวล
            เมื่อสมเด็จพระนเรศวรเสด็จถึงหนองสาหร่าย  ก็ทรงให้กองทัพพระศรีไสยณรงค์ กับ พระราชฤทธานนท์ ซึ่งออกไปขัดตาทัพอยู่ก่อนที่ลำน้ำท่าคอย  เลื่อนออกไปขัดตาทัพที่ดอนระฆัง  ส่วนกองทัพหลวงก็ทรงให้เตรียมค่ายคู  และกระบวนทัพที่จะรบข้าศึก  ด้วยคาดว่าคงจะได้ปะทะกันในวันสองวันเป็นแน่  เพราะกองทัพของทั้งสองฝ่ายอยู่ใกล้กันมากแล้ว  พระองค์ทรงจัดทัพเป็นขบวน  เบญจเสนา 5 ทัพ  ดังนี้
            ทัพที่ 1  เป็นกองหน้า  ให้พระยาสีหราชเดโชชัยเป็นนายทัพ  พระยาพิชัยรณฤทธิ์ เป็นปีกขวา  พระยาวิชิตณรงค์ เป็นปีกซ้าย
            ทัพที่ 2  เป็นกองเกียกกาย  ให้พระยาเทพอรชุน เป็นนายทัพ  พระยาพิชัยสงคราม เป็นปีกขวา  พระยารามคำแหง เป็นปีกซ้าย
            ทัพที่ 3  เป็นกองหลวง  สมเด็จพระนเรศวร ทรงเป็นจอมทัพ  พร้อมด้วยสมเด็จพระเอกาทศรถ  เจ้าพระยามหาเสนา เป็นปีกขวา  เจ้าพระยาจักรี เป็นปีกซ้าย
            ทัพที่ 4  เป็นกองยกกระบัตร  ให้พระยาพระคลัง เป็นนายทัพ  พระราชสงคราม เป็นปีกขวา  พระรามรณภพ เป็นปีกซ้าย
            ทัพที่ 5  เป็นกองหลัง  ให้พระยาท้ายน้ำ เป็นนายทัพ  หลวงหฤทัย เป็นปีกขวา  หลวงอภัยสุรินทร์เป็นปีกซ้าย
            ค่ายที่หนองสาหร่ายนี้  ทรงให้ตั้งเป็นกระบวนปทุมพยุหะเป็นรูปดอกบัว  และเลือกชัยภูมิครุฑนาม  เพื่อข่มกองทัพข้าศึกซึ่งตั้งในชัยภูมินาคนาม  ตามหลักตำราพิชัยสงคราม
            ครั้นถึงวันแรม 1 ค่ำ เดือนยี่  พระยาศรีไสยณรงค์บอกมากราบทูลว่า  ข้าศึกยกกองทัพใหญ่พ้น บ้านจรเข้สามพันมาแล้ว  สมเด็จพระนเรศวรจึงมีรับสั่งให้กองทัพทั้งปวง เตรียมตัวรบข้าศึกในวันรุ่งขึ้น  แล้วสั่งให้พระยาศรีไสยณรงค์ ยกออกไปหยั่งกำลังข้าศึก แล้วให้ถอยกลับมา
            ในวันจันทร์  แรม 2 ค่ำ เดือนยี่  สมเด็จพระนเรศวรกับสมเด็จพระเอกาทศรถ  ทรงเครื่องพิชัยยุทธ ให้ผูกช้างพระที่นั่งชื่อ พลายภูเขาทอง  ขึ้นระวางเป็นเจ้าพระยาไชยานุภาพ  เป็นพระคชาธารของพระองค์  มีเจ้ารามราฆพเป็นกลางช้าง นายมหานุภาพเป็นควาญ  อีกช้างหนึ่งชื่อพลายบุญเรือง  ขึ้นระวางเป็นเจ้าพระยาปราบไตรจักร  เป็นพระคชาธารสมเด็จพระเอกาทศรถ  มีหมื่นภักดีศวรเป็นกลางช้าง ขุนศรีคชคงเป็นควาญ พร้อมด้วย นายแวง จตุลังคบาท  พวกทหารคู่พระทัยสำหรับรักษาพระองค์
            ขณะนั้นเสียงปืนจากการปะทะกัน ระหว่างทัพหน้าของไทย กับทัพหน้าของพม่าดังขึ้น  พระองค์จึงดำรัสให้จมื่นทิพเสนา ปลัดกรมตำรวจ เอาม้าเร็วไปสืบข่าว ได้ความว่า  พระยาศรีไสยณรงค์ได้ยกกำลังออกไป และได้ปะทะกับข้าศึกที่ ตำบลดอนเผาข้าวเมื่อเวลาเช้า  ฝ่ายข้าศึกมีกำลังมากต้านทานไม่ไหว จึงแตกถอยร่นมา  สมเด็จพระนเรศวรจึงปรึกษาแม่ทัพนายกองว่า สถานการณ์เช่นนี้ควรจะทำอย่างไร  บรรดาแม่ทัพนายกองทั้งหลายกราบทูลว่า ควรให้มีกองทัพหนุน ออกไปช่วยต้านทานข้าศึกไว้ให้อยู่เสียก่อน  แล้วจึงให้ทัพหลวงออกมาตีภายหลัง  สมเด็จพระนเรศวรไม่ทรงเห็นชอบด้วย  มีพระดำรัสว่า กองทัพแตกลงมาเช่นนี้แล้ว  จะให้กองทัพไปหนุน ไหนจะรับไว้อยู่  มาปะทะกันเข้าก็จะพากันแตกลงมาด้วยกัน  ควรที่จะล่าถอยลงมาโดยเร็ว  เพื่อปล่อยให้ข้าศึกยกติดตามมาอย่างไม่เป็นกระบวน พอได้ทีให้ยกกำลังส่วนใหญ่เข้าโจมตีข้าศึก ก็คงจะได้ชัยชนะโดยง่าย  สมเด็จพระนเรศวรจึงมีรับสั่งให้จมื่นทิพเสนา กับ จมื่นราชามาตย์  ขึ้นม้าเร็ว รีบไปประกาศแก่พวกกองทัพหน้าของไทยว่า  อย่าได้รั้งรอข้าศึก ให้รีบล่าถอยหนีไปโดยเร็ว  กองทัพหน้าของพระยาศรีไสยณรงค์ก็พากันถอยหนีไม่เป็นกระบวน ข้าศึกเห็นดังนั้น ก็พากันรุกไล่ลงมาด้วยเห็นได้ที จนไม่เป็นกระบวนเช่นกัน
            สมเด็จพระนเรศวรสงบทัพหลวงรออยู่จน 11 นาฬิกา  เห็นข้าศึกตามลงมาไม่เป็นกระบวน ก็สมคะเน ทรงดำรัสสั่งให้บอกสัญญาณกองทัพทั้งปวง ให้ยกออกตีข้าศึก  พระองค์และพระเอกาทศรถ ยกกองทัพหลวงเข้าโอบกองทัพหน้าข้าศึก  ทัพท้าวพระยาอื่น ๆ ได้ทราบกระแสรับสั่งได้เร็วบ้างช้าบ้าง เนื่องจากเหตุการณ์กระทันหัน มีเวลาน้อยมาก  ทำให้ยกไปไม่ทันเสด็จเป็นส่วนมาก  คงมีแต่กองทัพพระยาสีหราชเดโชชัย กับกองทัพเจ้าพระยามหาเสนาซึ่งเป็นปีกขวา  ตามกองทัพหลวงเข้าจู่โจมข้าศึก  กองทัพหน้าของพม่าไม่คาดว่าว่าจะมีกองทัพไทยไปยอทัพ ก็เสียทีแตกหนีอลหม่าน
            เหตุการณ์ตอนนี้มีเรื่องบันทึกไว้ในบางแห่งว่า  ขณะที่สมเด็จพระนเรศวรประทับรอฟังข่าวทัพหน้าอยู่นั้น ได้บังเกิดเมฆเยือกเย็น ตั้งเค้ามืดอยู่ทางทิศตะวันตกเฉียงเหนือ  แล้วกลับกลายเป็นเปิดโล่ง  เห็นดวงตะวันสาดแสงสว่างกระจ่างตา  สมเด็จพระนเรศวรและสมเด็จพระเอกาทศรถ ทรงเคลื่อนทัพตามเกล็ดนาค  ซึ่งตามตำราพิชัยสงครามได้กำหนดไว้ว่า  ในวันใดหัวนาคและหางนาคอยู่ทางทิศใด  ต้องไปตั้งทัพทางหัวนาค  แล้วเคลื่อนทัพไปทางหางนาค  เป็นการเคลื่อนที่ตามเกล็ดนาค  ไม่ให้เคลื่อนที่ย้อนเกล็ดนาค  เมื่อช้างพระที่นั่งของทั้งสองพระองค์ได้ยินเสียงฆ้องกลองรบ  และเสียงปืนที่ทั้งสองฝ่ายยิงต่อสู้กัน  ก็เกิดความคึกคะนองด้วยเหตุที่กำลังตกมัน  แล้ววิ่งถลันเข้าไปในหมู่ข้าศึก  ควาญไม่สามารถคัดท้ายอยู่  บรรดาแม่ทัพนายกองและไพร่พลทั้งปวงตามเสด็จไม่ทัน  ผู้ที่สามารถตามเสด็จไปด้วยได้ คงมีแต่ผู้ที่มีหน้าที่อยู่ประจำช้างพระที่นั่ง  คือกลางช้าง ควาญช้าง และจตุลังคบาท ที่มีหน้าที่รักษาเท้าช้าง  สมเด็จพระนเรศวรและสมเด็จพระเอกาทศรถ  ทอดพระเนตรเห็นข้าศึกมีกำลังมากมาย  ไม่เป็นทัพเป็นกอง จึงทรงไสช้างพระที่นั่งเข้าชนช้างข้าศึก  เหล่าข้าศึกพากันระดมยิงอาวุธมาดังห่าฝน  แต่ไม่ถูกช้างทรง  ทันใดนั้นก็บังเกิดตะวันตลบมืด ท้องฟ้ามืดมิดราวกับไม่มีแสงตะวัน จนมองไม่เห็นกัน  สมเด็จพระนเรศวรทรงเห็นดังนั้น จึงได้ประกาศแก่เทวดา พระพรหมทุกชั้นฟ้า    ถึงปณิธานของพระองค์ที่ได้มาสืบวงศ์กษัตริย์  และมุ่งหวังที่จะทำนุบำรุงพระบวรพุทธศาสนา  ทันใดนั้นก็บังเกิดพายุใหญ่พัดปั่นป่วนในท้องฟ้า  สนามรบก็สว่างแจ้ง  พระองค์แลไปเห็นนายทัพข้าศึก นั่งอยู่บนหลังช้างเผือกตัวหนึ่ง  มีฉัตรกั้นอยู่ใต้ร่มต้นข่อย มีพล 4 เหล่า  เรียงรายอยู่มากมาย  ก็ทรงตระหนักแน่พระทัยว่าเป็นพระมหาอุปราชา
            เหตุการณ์ในตอนนี้มีอยู่หลายสำนวน  ตามพระราชพงศาวดารกล่าวไว้ว่า ให้เอาพลายภูเขาทอง ขึ้นระวางสะพัด ชื่อเจ้าพระยาไชยานุภาพ  สูง 6 ศอกคืบ 2 นิ้ว  ติดน้ำมันหน้าหลัง  เป็นคชาธารสมเด็จพระนเรศวร  และให้เอาพลายบุญเรืองขึ้นระวางสะพัด ชื่อเจ้าพระยาปราบไตรจักร สูง 6 ศอก 2 คืบ ติดน้ำมันหน้าหลัง เป็นพระคชาธารสมเด็จพระอนุชาธิราชพระเอกาทศรถ  ส่วนพระคชาธารของพระมหาอุปราชานั้น ชื่อพลายพัทธกอ สูง 6 ศอกคืบ  6 นิ้ว  ติดน้ำมันหน้าหลังเช่นเดียวกัน
            สมเด็จพระเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์  ยาตราพระคชาธารเป็นบาทย่างสะเทินมา  บ่ายหน้าต่อข้าศึก  เจ้าพระยาไชยานุภาพ  เจ้าพระยาปราบไตรจักร  ได้ยินเสียงพลและเสียงฆ้องกลองอึงคะนึง ก็เรียกมันครั่นครื้น กางหูชูหางกิริยาป่วนเป็นบาทย่างใหญ่ เร็วไปด้วยกำลังน้ำมัน  ช้างท้าวพระยามุขมนตรี และโยธาหาญซ้ายขวาหลังนั้นตกลง  ไปมิทันเสด็จ  พระเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์ใกล้ทัพหน้าข้าศึก  ทอดพระเนตรเห็นพลพม่ารามัญนั้นยกมาเต็มท้องทุ่ง  เดินดุจคลื่นในมหาสมุทร  พลข้าศึกไล่พลชาวพระนครครั้งนั้น สลับซับซ้อนกันมิได้เป็นกระบวน  สมเด็จพระเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์  ก็ขับพระคชาธารเข้าโจมแทงช้างม้ารี้พลปรปักษ์  ไล่สายเสยถีบฉัดตะลุมบอน  พลพม่ารามัญตายเกลื่อนกลาด  ช้างข้าศึกได้กลิ่นน้ำมันพระคชาธาร ก็หกหันตลบปะกันไปเป็นอลหม่าน  พลพม่ารามัญก็โทรมยิงธนู หน้าไม้ ปืนไฟ ระดมเอาพระคชาธารสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์  และธุมาการก็ตรลบมืดเป็นหมอกมัวไป มิได้เห็นกันประจักษ์
            สำนวนของวันวลิต ชาวฮอลันดา  ซึ่งเข้ามาที่กรุงศรีอยุธยา เมื่อปี พ.ศ. 2176 ได้บรรยายเหตุการณ์ตอนนี้ไว้ว่า  พระเจ้ากรุงหงสาวดียกทัพอันมีกำลังใหญ่หลวง มายังกรุงศรีอยุธยา  พระนเรศวรยกทัพมาถึงวัดร้างแห่งหนึ่ง เรียกว่า เครง หรือ หนองสาหร่าย  เพื่อปะทะทัพมอญ  เมื่อกองทัพทั้งสองมาประจัญกันเข้า  พระนเรศวรและพระมหาอุปราชา (ซึ่งต่างก็ทรงเครื่องอย่างกษัตริย์ และประทับบนพระคชาธาร) ต่างทอดพระเนตรเห็นกันเข้า  ต่างองค์ก็มีพระทัยฮึกเหิม  เสด็จออกจากกองทัพ  ขับพระคชาธารโดยปราศจากรี้พลเข้าหากัน  แต่พระคชาธารที่พระนเรศวรทรงอยู่นั้น  เล็กกว่าช้างทรงพระมหาอุปราชามากนัก  เมื่อกษัตริย์ทั้งสองพระองค์มุ่งเข้าหากัน  ช้างที่เล็กกว่าก็ตกใจกลัวช้างที่ใหญ่กว่า ถึงกับเบนหัวจะถอยกลับ  พระนเรศวรทรงเห็นดังนั้น จึงตรัสปลอบพระยาช้างต้นให้มีใจฮึกเหิมกลับมาสู้ช้างข้าศึก และทรงพรมน้ำเทพมนต์ซึ่งพราหมณ์ได้ทำถวายไว้สำหรับโอกาสนี้ ลงบนศีรษะช้าง  พระยาช้างต้นผู้ชาญฉลาดเมื่อได้รับน้ำเทพมนต์  และได้ยินเสียงพระราชดำรัสของวีรกษัตริย์ก็มีใจฮึกเหิม  ชูงวงขึ้นประณตแล้วเบนหัวสู่ข้าศึก  พลันวิ่งพุ่งเข้าสู่กษัตริย์มอญอย่างเมามัน  อำนาจของพระยาช้างต้นในการสู้รบครั้งนี้ แลดูน่าสพึงกลัว และน่าอัศจรรย์ยิ่งนัก
            ทั้งหมดที่กล่าวมา  เป็นเหตุการณ์ก่อนที่จะเริ่มเข้าสู่การกระทำยุทธหัตถีของสองกษัตริย์  และสมเด็จพระนเรศวรมหาราช ทรงได้ชัยชนะอย่างงดงาม  เป็นที่เลื่องลือไปทั่วทิศานุทิศ  ข้าศึกศัตรูไม่หาญกล้ามาเบียดเบียนราชอาณาจักรไทยอีกเลยถึง 160 ปี

            สมเด็จพระนเรศวรจึงทรงขับช้างพระที่นั่งตรงไปยังพระมหาอุปราชา  แล้วร้องตรัสไปโดยฐานที่คุ้นเคยกันมาแต่ก่อน มีความว่า
            "เจ้าพี่จะยืนช้างอยู่ในที่ร่มไม้ทำไม  เชิญเสด็จมาทำยุทธหัตถีกันให้เป็นเกียรติยศเถิด  กษัตริย์ภายหน้า ที่จะทำยุทธหัตถีได้อย่างเรา จะไม่มีแล้ว"
            พระมหาอุปราชา  เมื่อทรงได้ยินดังนั้นก็ขับพลายพัทธกอซึ่งเป็นพระคชาธาร  ออกมาชนกับเจ้าพระยาไชยานุภาพ  พระคชาธารของสมเด็จพระนเรศวร  ในชั้นแรก เจ้าพระยาไชยานุภาพเสียที พลายพัทธกอได้ล่างแบกรุน  พระยาไชยานุภาพเบนจะขวางตัว  พระมหาอุปราชาได้ทีฟันด้วยพระแสงของ้าว  สมเด็จพระนเรศวรเบี่ยงพระองค์หลบทัน  ถูกแต่พระมาลาหนังขาดลิไป  พอพระยาไชยานุภาพสะบัดหลุด แล้วกลับชนได้ล่างแบกถนัดรุนพลายพัทธกอหัวเบนไป  สมเด็จพระนเรศวรก็จ้วงฟันด้วยพระแสงของ้าว  ถูกพระมหาอุปราชาที่ไหล่ขวาขาด  สิ้นพระชนม์อยู่บนคอช้าง  ส่วนสมเด็จพระเอกาทศรถก็ได้ชนช้างกับเจ้าเมืองจาปะโร และฟันเจ้าเมืองจาปะโรตายเช่นกัน  ทหารพม่าก็เข้ามากันพระศพพระมหาอุปราชา และเจ้าเมืองจาปะโรออกไป  แล้วเข้าระดมยิงถูกสมเด็จพระนเรศวรที่พระหัตถ์ได้รับบาดเจ็บ  และถูกนายมหานุภาพควาญช้างพระที่นั่ง กับหมื่นภักดีศวรกลางช้างสมเด็จพระเอกาทศรถ ตายทั้งสองคน  ขณะนั้น กองทัพเจ้าพระยามหาเสนา พระยาสีหราชเดโชชัยตามไปทัน  ก็ช่วยกันรบพุ่งแก้กันทั้งสองพระองค์ออกมาได้  สมเด็จพระนเรศวรทรงเห็นว่า  กองทัพข้าศึกแตกเฉพาะทัพหน้า กำลังฝ่ายไทยที่ตามเสด็จไปถึงเวลานั้นมีน้อยนัก  จึงจำต้องเสด็จกลับมาค่ายหลวง  ฝ่ายข้าศึกก็เชิญพระศพพระมหาอุปราชา เลิกทัพกลับไปเมืองหงสาวดี  เหตุการณ์ในตอนนี้ วัน วลิต ได้บรรยายไว้ว่า
            ช้างข้าศึกพยายามเอางาเสยพระคชาธารให้ถอยห่างอยู่ตลอดเวลา  แต่ในที่สุดพระคชาธารซึ่งเล็กกว่าก็ได้ทีช้างข้าศึก  โดยช้างข้าศึกไม่ทันรู้ตัว  ขึ้นเสยช้างข้าศึกแล้วเอางวงตีด้วยกำลังแรงยิ่งนัก  จนช้างข้าศึกร้องขึ้น  กษัตริย์มอญก็ตกพระทัย  กษัตริย์ไทยเห็นได้ทีก็เอาพระแสงขอ ตีต้องพระเศียรกษัตริย์มอญ  แล้วใช้พระแสงทวนแทงจนกษัตริย์มอญตกช้างสิ้นพระชนม์  แล้วทรงจับช้างทรงของกษัตริย์มอญนั้นไว้ได้ ทหารรักษาพระองค์ซึ่งตามมาโดยไม่ช้า ก็แทงชาวโปรตุเกส ซึ่งนั่งอยู่เบื้องหลังกษัตริย์มอญนั้นตาย  เมื่อกองทัพมอญเห็นกษัตริย์ของตนสิ้นพระชนม์  ก็พากันล่าถอยไม่เป็นกระบวน  กองทัพไทยก็ไล่ติดตามไปอย่างกล้าหาญ  จับเป็นได้เป็นจำนวนมาก  ฆ่าตายเสียก็มาก ที่เหลือนั้นก็แตกกระจัดกระจายไปประดุจแกลบต้องลม  ทหารมอญหลายพันคนต้องตกค้างอยู่ และเมื่อต้องถอยทัพกลับโดยที่ขาดแคลนเสบียงอาหาร  จึงกลับไปถึงเมืองมอญได้น้อยคนนัก
            สมเด็จพระนเรศวรมีชัยในการกระทำยุทธหัตถีครั้งนี้  พระเกียรติยศได้เลื่องลือไปทั่วทุกประเทศในชมพูทวีป  ด้วยถือเป็นคติมาแต่โบราณว่า  การชนช้างเป็นยอดวีรกรรมของนักรบ  เพราะเป็นการต่อสู้ตัวต่อตัว มิได้อาศัยกำลังพล  หรือกลยุทธใดๆ  เป็นการแพ้ชนะกันด้วยฝีไม้ลายมือและความแกล้วกล้า  นอกจากนั้น โอกาสที่จะมีเหตุการณ์ดังกล่าวก็มีน้อย  ดังนั้น ถ้ากษัตริย์พระองค์ใดกระทำยุทธหัตถีได้ชัยชนะ  ก็จะได้รับความยกย่องว่ามีพระเกียรติยศอย่างสูงสุด  ถึงเป็นผู้แพ้ ก็ได้รับการยกย่องสรรเสริญ ว่าเป็นนักรบแท้

            ด้วยเหตุผลดังกล่าว  สมเด็จพระนเรศวรจึงโปรดให้สร้างพระเจดีย์ขึ้นองค์หนึ่ง  ตรงที่ได้กระทำยุทธหัตถีกับพระมหาอุปราชา  ณ ตำบลท่าคอย  ซึ่งปัจจุบันเป็นตำบลดอนเจดีย์  อยู่ห่างจากหนองสาหร่ายไปประมาณ 100 เส้น  พระเจดีย์ทิ้งร้างมานานหลายร้อยปี  เพิ่งมาพบเมื่อปี พ.ศ.  2456  วัดฐานเจดีย์ได้ด้านละ 10 วา  ความสูงประมาณ 20 วา  ต่อมา ได้มีการบูรณะเป็นรูปแบบที่สมบูรณ์ ตามแบบอย่างเจดีย์ที่วัดใหญ่ชัยมงคล  ซึ่งสันนิษฐานว่า สมเด็จพระนเรศวรทรงให้สร้างขึ้นเป็นอนุสรณ์ แห่งชัยชนะครั้งนั้น  ตามคำกราบทูลแนะนำของสมเด็จพระพนรัตน์วัดป่าแก้ว  เป็นเจดีย์กลมแบบลังกา  ดังที่ปรากฎอยู่ปัจจุบันนี้
            สมเด็จพระนเรศวร  ทรงปูนบำเหน็จความชอบอันเนื่องมาจากการสงครามครั้งนี้โดยทั่วกัน คือ ช้างพระที่นั่งที่ชนชนะข้าศึก  พระราชทานนามว่า  เจ้าพระยาปราบหงสาวดี  พระแสงของ้าวก็ได้นามว่าเจ้าพระยาแสนพลพ่าย  นับถือเป็นพระแสงศักดิ์สิทธิ์ สำหรับพระเจ้าแผ่นดินทรงคชาธารในรัชกาลหลัง ๆ สืบมา  พระมาลาที่พระองค์ทรงในวันนั้น  ก็ปรากฎนามว่าพระมาลาเบี่ยง ดำรงคงอยู่มาถึงปัจจุบันนี้
            เมื่อเสร็จศึกแล้ว สมเด็จพระนเรศวรทรงโทมนัส ที่ไม่สามารถจะตีข้าศึกให้แตกยับเยินไปได้เหมือนครั้งก่อน เพราะเหตุที่แม่ทัพนายกองไม่สามารถตามเสด็จให้ทันการรบพุ่งพร้อมกัน พระองค์จึงให้ลูกขุน ประชุมปรึกษาโทษแม่ทัพนายกองเหล่านั้นตามพระอัยการศึก  ลูกขุนปรึกษากันแล้ววางบทว่า
            พระยาศรีไสยณรงค์  มีความผิดฐานฝ่าฝืนพระบรมราชโองการ ไปรบพุ่งข้าศึกโดยพละการจนเสียทัพแตกมา
            เจ้าพระยาจักรี  พระยาพระคลัง  พระยาเทพอรชุน  พระยาพิชัยสงคราม  พระยารามคำแหง  มีความผิดฐานละเลย มิได้ตามเสด็จให้ทันท่วงทีการพระราชสงคราม
            ทั้งหมดนี้ โทษถึงประหารชีวิตด้วยกัน  พระองค์จึงทรงให้เอาตัวคนทั้งหมดดังกล่าวไปจำตรุไว้ พอพ้นวันพระแล้ว  ให้เอาไปประหารชีวิตเสีย  ตามคำพิพากษาของลูกขุน